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Anti-ACA11蛋白降解后,根據(jù)降解程度不同可采取對應(yīng)補救方案,具體如下:
一、輕度降解(僅部分ACA11降解,內(nèi)參條帶正常,ACA11仍可檢出但信號減弱)
可以通過以下方法補救,無需重新提取:
?增加上樣量?:將原有上樣量從20-40μg提升至50-60μg,彌補降解損失的靶標(biāo)量,不超過80μg避免膠過載;
?提升檢測靈敏度?:將抗體濃度適當(dāng)提高50%(從1:1000調(diào)整為1:500),更換超敏ECL發(fā)光液,延長曝光時間,提升弱信號檢出能力;
**后續(xù)操作規(guī)范:剩余樣本立即分裝,后續(xù)每次只用1管,避免繼續(xù)凍融降解。
二、中度降解(內(nèi)參條帶變暗,ACA11信號非常弱幾乎看不見)
優(yōu)先選擇「重新提取+優(yōu)化制備流程」,這是的補救方式:
取用新鮮的擬南芥組織,全程冰上操作,裂解液中額外添加蛋白酶抑制劑(可以加倍用量,提升抑制效果);
提取后立即用膜蛋白提取試劑盒富集ACA11,提升靶標(biāo)濃度,減少雜蛋白干擾;
提取完成立刻按單次用量分裝成小份,-80℃凍存(比-20℃更穩(wěn)定,能延緩降解),避免反復(fù)凍融。
三、重度降解(內(nèi)參無條帶/彌散,ACA11無信號)
這種情況已經(jīng)無法補救,必須丟棄原有樣本,重新提取新鮮組織制備樣本,提取時嚴(yán)格遵循以下規(guī)范避免再次降解:
全程冰上操作,組織取出后立即放入預(yù)冷的裂解液,減少蛋白酶作用時間;
必須添加足量蛋白酶抑制劑,提取后1小時內(nèi)完成分裝凍存;
嚴(yán)格按單次用量分裝,絕對禁止反復(fù)凍融。